许多哺乳动物能够通过在囊胚阶段暂停胚胎发育来调控妊娠和分娩的时间。发育暂停的能力是否在哺乳动物中普遍保守存在，尤其是否存在于人类中，仍属未知。调控生长的 mTOR 通路活性决定了小鼠中的发育暂停（
早期哺乳动物发育的时间可在体内通过将囊胚期胚胎自然保存于休眠状态数周至数月而得到控制（
尽管并非所有哺乳动物都会在其生殖周期中采用滞育，但种间子宫移植实验提示，进入滞育的能力可能普遍存在于哺乳动物之中（
人类是否存在滞育的可能性曾被提出，但迄今尚未有令人信服的证据加以证明（
我们此前已发现，mTOR 通路调控小鼠中的发育暂停（
在此，我们表明，人类模型胚胎（类囊胚，blastoids）以及多能干细胞（PSCs）均可通过 mTORi 进入一种类似滞育的、稳定且可逆的休眠状态。通过比较 naïve（PXGL）、naïve-like（RSeT）和 primed（mTeSR）培养条件，我们证明人类 PSCs 中存在阶段特异性的滞育响应，并且其与小鼠滞育具有共同特征。我们还发现，人类细胞表现出物种特异性的通路利用方式以及不同的休眠进程。这些结果提示，有可能通过延长植入前阶段发育适能的时间窗口来调控人类早期发育的时间进程。
由于 mTOR 通路是决定小鼠囊胚处于休眠还是增殖状态的主要调控因子，我们首先表征了人类囊胚中的 mTOR 活性水平及其模式，并与小鼠进行了比较（
mTOR 通路响应营养物质以及环境中的某些生长因子，调控细胞生长与增殖（
为在可逆体系中稳健地检验人类滞育反应，我们选择了近期建立的类囊胚模型。类囊胚是来源于胚胎干细胞的结构，其在形态和转录组层面均与人类囊胚高度相似（模拟第 5 至第 7 天）（
为检测 mTOR 抑制对人类类囊胚发育时间进程和形态的影响，首先形成类囊胚，随后在 mTOR 抑制剂 RapaLink-1 存在条件下继续培养（
a. 在对照条件下培养或经 mTOR 抑制剂 RapaLink-1 处理的类囊胚明场图像。所示时间点（第 1–8 天）表示类囊胚形成后的培养时间（自 ESC 培养开始 96 h 后）。
b. 人类正常类囊胚和暂停类囊胚的明场图像，并与延长培养的未处理类囊胚进行比较。右侧面板显示基于免疫荧光染色对 ICM 和 TE 中细胞数量的定量结果。
c. 小鼠正常及滞育囊胚（体外和体内）的明场图像，并与扩展培养中的未经处理的类囊胚进行比较。右侧面板显示基于免疫荧光染色对内细胞团（ICM）和滋养外胚层（TE）细胞数量的定量分析。
d. 对照类囊胚以及经所示浓度 mTOR 抑制剂 RapaLink-1 处理的类囊胚的纵向形态学评分。类囊胚在结构塌陷后不再被视为完整。n = 处理的类囊胚数量。
e. 对 ICM 标志物 OCT4 和 NANOG、TE 标志物 GATA3 和 CDX2，以及原始内胚层（PrE）标志物 GATA4 和 SOX17 的免疫荧光（IF）染色。共对 16 个对照类囊胚和 15 个滞育类囊胚进行了染色。15 个滞育类囊胚中有 3 个、16 个对照类囊胚中有 2 个显示出线性组织的 PrE 层（如右上方面板所示）。
f. 滞育后的再激活及植入后扩展培养。类囊胚经 mTOR 抑制剂处理 4 天，随后撤除 mTOR 抑制剂，并将类囊胚接种于 Matrigel 包被的培养板上培养（
在子宫内，滞育胚胎在接收到生长信号后会重新激活并完成植入。为检验 mTOR 抑制剂诱导的滞育是否同样可逆，我们在经 mTOR 抑制剂处理 2–6 天后对滞育类囊胚进行再激活，并进一步将其置于 Matrigel 包被的培养板上培养（
我们此前已证明，在 mTOR 抑制条件下的小鼠初始型多能干细胞（PSC）能够忠实模拟滞育上胚层，包括高度的转录相似性（
小鼠和人类 PSC 均可在体外获得，表现出初始型或始发型多能性的分子与表观遗传特征以及形态学特性，这些特性分别反映囊胚（
引人注目的是，在 PXGL 条件下培养的人类初始型 PSC 对小鼠胚胎干细胞（ESC）表现出类似反应，并稳定进入一种增殖较低且可逆的多能状态。在 mTOR 抑制条件下，初始型 PSC 可维持 18 天（测试的最长时间），随后可解除抑制并反复再次诱导滞育，而不损害集落形态（
迄今为止，小鼠和人类 PSC 均使用 mTOR 抑制剂 INK128 进行滞育处理，因为先前研究表明该抑制剂可有效在小鼠 ESC 中诱导一种类似滞育的状态（
到目前为止，我们的结果表明，人类 PSC 以及类囊胚均具有进入滞育状态的能力，且这种滞育在功能上是可逆的。接下来，我们旨在从分子层面探究滞育可逆性，鉴定相关通路，并更全面地比较 PXGL 和 RSeT 条件。为此，我们收集了正常、稳定滞育和释放后的细胞，并进行了无标记定量蛋白质组学质谱分析（
为了探究哺乳动物中可能保守的滞育反应，我们进一步比较了小鼠和人类初始型 PSC 在进入休眠状态的细胞转变过程中其时间动态和通路利用情况。为此，我们在小鼠和人类中收集了最长达 10 天的匹配时间点样本，并进行了蛋白质组学分析（
小鼠和人类的发育时钟本质上是不同的，因此我们想知道，在这些物种中，滞育是否以相似或不同的速度建立。纵向样本的相关矩阵显示，人类和小鼠细胞中存在不同的“断点”，在此之后，暂停的蛋白质组特征趋于稳定（人类 = d6，小鼠 = d2，
一旦稳定下来，人类和小鼠的暂停蛋白质组在蛋白水平和通路水平上表现出相关性（
最后，我们试图利用囊胚样体模型，验证基于暂停状态人类PSC蛋白质组分析所预测的物种特异性代谢需求。蛋白质组分析指出，脂肪酸是小鼠特异性的能量来源，用于维持暂停状态（
众所周知，人类胚胎在早期发育进程中的推进能力存在显著变异，据估计，约有1/3的妊娠会在孕早期因遗传和非遗传异常而失败（
一旦建立并稳定，暂停状态的hPSC和囊胚样体在撤除mTORi后可轻易重新激活。然而，初始的naïve和naïve-like hPSC群体在进入暂停状态的能力方面表现出异质性。这种异质性的根本原因仍有待探索。我们推测，细胞进入暂停状态时的转录状态或细胞周期阶段可能是影响因素（
近年来，受调控的翻译已成为连接干细胞活性与微环境的重要新参与者（
ABK和DPI构思了该项目。DPI建立了人类PSC暂停模型并完成了所有干细胞实验。VAvdW进行了计算分析和小鼠胚胎染色。HHK在NR指导下进行了囊胚样体实验。ID和EGS提供了资源。AM、TR、CSS和SEW在KKN监督下进行了人类胚胎实验。KE、PS和LC协调了胚胎捐献。ABK监督了整个项目。DPI、VAvdW、NR和ABK撰写了手稿，所有作者均提供了反馈。
在PXGL和RSeT培养条件下，正常、暂停（d6）和释放后人类细胞中多能性相关基因OCT4及细胞分裂标志物H3S10p的水平。右侧面板显示了所有采集图像的单细胞定量结果。n表示分析的细胞数。比例尺，50 mm。所采用的统计检验为单因素方差分析（one-way ANOVA），并进行了Tukey多重比较校正。
mTOR下游靶标pS6和pAKT的免疫荧光染色。底部面板显示按面积归一化的单细胞染色强度定量结果。虚线：中位数；点线：四分位数。比例尺，50 mm。所采用的统计检验为双尾Kolmogorov-Smirnov t检验。
在人类受精与胚胎管理局（Human Fertilization and Embryo Authority，HFEA）许可证编号 R0162 的监管下，研究项目通过知情同意获得了人类胚胎捐赠。该项目还获得了英国卫生研究管理局剑桥中央研究伦理委员会的批准，IRAS 项目编号为 272218（剑桥中央参考编号 19/EE/0297）。审批过程包括独立同行评审，以及 HFEA 执行许可小组和执行委员会的批准。我们的研究符合 HFEA《操作规范》，并自许可证获批以来接受了 HFEA 的独立检查。
患者同意由 Bourn Hall Clinic 获取。所有在体外受精（IVF）治疗后捐赠剩余胚胎的夫妇均签署了知情同意。在签署同意之前，捐赠者获得了有关该研究项目的所有必要信息、接受咨询的机会，以及许可证和 HFEA《操作规范》中适用条件的详细说明。具体而言，患者签署了同意书，授权将其胚胎用于研究，包括干细胞建系，并允许将这些研究结果发表于科学期刊。捐赠未提供任何经济诱因。提供给患者的信息说明书和知情同意文件可公开获取（
冻存在细管中的玻璃化胚胎通过将细管内容物从液氮中快速直接转移至复苏液（Irvine Scientific Vitrification Thaw Kit）中进行复苏，并按照制造商说明操作。冻存在 cryopet 中的胚胎先于 37 °C 水浴中复温 3 秒，然后转移至复苏液（Irvine Scientific Vitrification Thaw Kit）中。冻存在玻璃安瓿中的胚胎则在液氮条件下去除瓶顶后，于 37 °C 水浴中完全复苏。
随后将内容物倒入培养皿中，并按照制造商说明，将胚胎依次转移通过蔗糖溶液梯度（Quinn’s Advantage Thaw Kit，Origio）。胚胎常规培养于 Global Media 中，补充 5 mg/mL LifeGlobal Human Protein Supplement（均为 LifeGlobal），并于 37 °C、5% CO₂ 培养箱中预平衡过夜。
根据《德国干细胞法》的要求，所有涉及人胚胎干细胞（hESCs）和/或 hESC 来源胚泡样体的实验均获得了柏林罗伯特·科赫研究所和奥地利科学院科学伦理委员会的批准。Wicell 的 H9 细胞系依据协议 20-WO-341 用于题为“模拟人类早期发育：建立基于干细胞的人类囊胚（三维）体外模型（blastoids）”的研究项目。尽管就胚胎模型而言，ISSCR 指南并不禁止这一点，但本研究并未超过通常与受精后连续培养 14 天相对应的发育阶段。
所有实验均符合所有相关指南和法规，包括 2021 年 ISSCR 指南；该指南禁止将人类胚泡样体移植入任何子宫（
所有动物实验均按照当地动物福利法律进行，并获得地方主管部门批准（涵盖 LaGeSo 许可证 ZH120、G0284/18 和 G021/19，以及英国本土事务部项目许可证（70/8560）），并在《1986 年动物（科学程序）法》规定的条件下开展。小鼠饲养于独立通风笼中，自由摄食。
野生型 Zip13k2 雌性 hiPSCs 在无饲养层条件下培养于 Matrigel 包被板（Corning，354277）上，使用 mTeSR 培养基，并在接种当天补充 10 mM ROCK 抑制剂（ROCKi）（Tocris，1254）。复苏后次日撤去 ROCKi，每日更换培养基，每四天传代一次。每次传代时，细胞用 EDTA 以团块形式解离，并按 1:5 的分瓶比例重新接种，同时加入 10 mM ROCKi。细胞维持于 37°C、20% O
为获得 naïve-like 细胞，将 primed hiPSCs 以中等密度（75% 汇合的 10 cm 培养皿的 1:3–1:4）接种于 Matrigel 包被培养皿（Corning，354277）上，并在 37°C、20% O 条件下于 mTeSR 培养基中培养 24 小时
H9 hESCs 培养于明胶包被板上，板中包含经丝裂霉素处理的小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs）饲养层，培养基为 PXGL。PXGL 培养基由 N2B27 基础培养基配制，并补充 PD0325901（1 µM，MedChemExpress，HY-10254）、XAV-939（2 µM，MedChemExpress，HY-15147）、Gö 6983（2 µM，MedChemExpress，HY-13689）以及人白血病抑制因子（hLIF，10 ng ml
小鼠胚胎干细胞（mouse ESCs）接种于 0.1% 明胶包被培养皿上，在高糖 DMEM/Glutamax 培养基（Thermo，31966047）中培养，培养基补充 15% FBS（Thermo，2206648RP）、1X NEAA（Thermo，11140-035）、1X β-巯基乙醇（Thermo，21985023）、1X 青霉素/链霉素（Life Technologies，15140148）和 1000U/mL LIF，并在 37°C、20% O
对于 primed hiPSCs 的暂停培养，细胞在 mTeSR 培养基中用催化型 mTOR 抑制剂 INK128（MedChemExpress/Biozol，MCE-HY-13328）处理，终浓度为 200 nM，并加入 10 mM ROCKi，处理 1 天。次日撤去 ROCKi，随后细胞在含 INK128 的培养基中继续培养 6 天，并每日更换培养基。
对于在 RSeT 培养条件下 hiPSCs 的暂停培养，10
对于在 PXGL 培养条件下使 hESCs 进入暂停状态，计数 400,000 个细胞，并将其接种到铺满的 MEFs 上，培养于含 10 mM ROCKi、Matrigel 和 200 nM INK128 的 PXGL 培养基中 1 天。次日用含 PXGL 和 200 nM INK128 的培养基更换培养液。
为验证 INK128 介导的暂停状态，使用 200 nM 的 RapaLink-1（Biozol, APE-A87764）以及 200–1000 nM 的 Torin1（Abcam, ab218606）。
对于小鼠 ESCs 的暂停处理，细胞以 200 nM 终浓度的 mTOR 抑制剂处理，并培养 6 天。根据需要补充培养基。
对于胚胎收集，采用 F1（C57Bl/6xCBA）雌鼠进行超排卵以获得受精卵。将超排卵雌鼠与 8 周龄或以上的 F1（C57Bl/6xCBA）雄鼠交配。E0.5 胚胎从肿胀的输卵管壶腹部采集于 FHM 培养基（Millipore #MR-024-D;27:50）中，经透明质酸酶（Sigma-Aldrich; H4272）处理以去除卵丘细胞，随后将胚胎置于预平衡的 KSOM 培养基液滴中培养，液滴上覆盖矿物油（Origio; ART-4008-5P），培养条件为 37.5°C、5% CO2。
体内滞育通过 CD1 小鼠自然交配后诱导。妊娠雌鼠于 E3.5 行卵巢切除术，之后每隔一天皮下注射 3 mg 醋酸甲羟孕酮。滞育胚泡在 EDG7.5、经历 3 天滞育后，用 M2 培养基自子宫中冲洗获得。
细胞培养于玻璃盖玻片上，在室温下用 4% PFA 固定 10 min，以 PBS 清洗 1 次，随后在冰上用 PBS 中 0.2% Triton-X100 透化 5 min。以 PBS-T（含 0.2% Tween-20 的 PBS）清洗 1 次后，细胞在封闭液（PBS-T、2% BSA 和 5% 山羊血清（Jackson Immunoresearch/Dianova, 017-000-121））中于室温封闭 1 h。
随后细胞于 4°C 过夜孵育以下一抗：pS6（CST，货号：4858）1:200，pAKT（CST，4060T）1:200，KI67（BD Pharmingen，556003）1:400，H3 phosphoS10（Abcam，ab5176）1:1000，OCT4（Santa Cruz，sc5279）1:50，NANOG（Abcam，ab109250）1:200，gH2A.X（Biolegend，613405）1:400。
细胞随后以洗涤液（PBS-T，2% BSA）清洗 3 次，每次 10 min。将偶联 Alexa Fluor 的抗兔（Thermo，A10042）或抗鼠（Thermo，21202）二抗按 1:700 稀释于封闭液中加入细胞，在室温下孵育 1 h，随后再以洗涤液清洗 3 次，每次 10 min。之后使用含 DAPI 的 Vectashield（Vector labs，H-2000）封片，并用指甲油封固。
成像采用 Zeiss LSM880 Airy 显微镜的 Airy scan 模式完成，图像处理使用 Zen black 和 Zen blue 软件（版本 2.3）。图像定量分析使用 CellProfiler（版本 4.2.1）进行，其中将细胞核或细胞定义为初级对象，并测定相应蛋白染色相对于细胞核或细胞面积的标准化强度。
人胚胎在4°C条件下于PBS中的4%多聚甲醛中固定1 h，小鼠胚胎则在室温下固定10 min。胚胎先用PBS清洗一次，随后用含0.5% Triton X-100的1× PBS进行透化，然后在封闭液［含0.1% Triton X-100的1× PBS中加入10% FBS］中于室温旋转振荡器上封闭1–2 h。随后将胚胎置于用封闭液稀释的一抗中，在4°C旋转振荡器上孵育过夜。
次日，胚胎在室温旋转振荡器上用含0.1% Triton X-100的1× PBS清洗一次，然后在避光条件下，于室温旋转振荡器上用封闭液稀释的二抗孵育1 h。胚胎随后用含0.1% Triton X-100的1× PBS清洗，并用DAPI进行复染。
所用抗体及稀释倍数如下：anti-pS6（Cell Signaling，4858）1:250，anti-OCT4（Santa Cruz，5279）1:50，anti-Nanog（R&D，AF1997）1:200，anti-CDX2（BioGenex，MU392-UC）1:100，anti-pAKT（CST 4060T）1:100，anti-4EBP1（CST 2855）1:100，anti-Lamin B1（Abcam ab16048）1:100，以及anti-GATA3（R&D AF2605）1:200。
所有二抗均为Alexa Fluor（Life Technologies）标记、来源于驴，使用稀释度为1:200至1:1000。成像时，将胚胎置于PBS中的µ-Slide 18 Well Flat培养皿（Ibidi，81826）上，使用Leica Sp8共聚焦显微镜及Leica HCX PL APO 63x / 1.3 GLYC CORR CS物镜进行成像。z轴层扫步长为3.5–5 mm。小鼠胚胎的成像使用Zeiss LSM880 Airy显微镜并采用Airy scan模式完成。
用于凋亡检测时，收集了贴壁细胞以及悬浮细胞。细胞使用TrypLE消化分散，经冷PBS清洗后，重悬于Annexin结合缓冲液（10 mM HEPES、140 mM NaCl和2.5 mM CaCl
为研究细胞周期分布，采用Click-iT EdU Alexa Fluor 488流式细胞术检测试剂盒（Thermo Fisher，C10425）。正常和暂停状态的iPSC在37°C、5% O
每个样本取5000个细胞，在变性缓冲液中裂解，随后进行还原和烷基化处理，并依次用Lys-C和胰蛋白酶消化。每份样本中来源于约1000个细胞的肽段按照制造商说明加载至Evotips Pure（Evosep，丹麦欧登塞）。肽段分离采用纳升级反相液相色谱（Evosep One，Evosep）进行，使用Endurance色谱柱（15 cm × 150 µm内径，填料为Reprosil-Pur C18 1.9 µm微珠，#EV1106，Evosep），并采用每日30个样本的方法（30SPD）。
液相色谱系统在线联用timsTOF SCP质谱仪（Bruker Daltonics，德国不来梅），采用数据非依赖采集（DIA）结合并行累积串行碎裂（PASEF）方法（
蛋白质组学样本制备按照已发表方案进行，并作了少量修改（
采用纳升级流速反相液相色谱（Dionex Ultimate 3000，Thermo Scientific）联用在线 Q-Exactive HF Orbitrap 质谱仪（Thermo Scientific）进行 LC-MS/MS 分析，如前所述（
原始质谱数据使用 MaxQuant 软件（v1.6.10.43）进行处理，并基于 2019 年 8 月发布、包含 55,153 个条目的小鼠蛋白质组数据库 UniProtKB 进行检索。经 MaxQuant 处理后的输出文件见表 S1，显示了肽段和蛋白质鉴定结果、登录号、蛋白质序列覆盖率（% sequence coverage）、q 值以及无标记定量（LFQ）强度。
在 R 中使用蛋白质组学数据差异富集分析软件包 DEP（v1.16.0）进行蛋白质组学数据预处理和统计分析（
蛋白质组谱的整体变化通过正常状态与暂停状态 iPSC 的平均 LFQ 值进行展示，并使用 ggplot2 生成。
为鉴定富集的生物学过程，对差异表达蛋白（DEPs）中 p.adj < 0.05 且 |log2FC| > 1 的蛋白应用 clusterProfiler R 软件包中的基因本体论分析（
在人（PXGL）和小鼠数据中共有 2861 种蛋白质被表达。该对数
对数据进行了筛选，仅保留在至少一种条件下两个样本中均有表达的蛋白质。使用 DEP 软件包对数据进行标准化，并通过从以最小值为中心的高斯分布中随机抽样对缺失值进行插补。利用在人和小鼠 ES 细胞中均表达的蛋白质，采用 R（version 4.2.1）中的 destiny 软件包（v3.10）计算扩散映射伪时间。物种特异性数据则使用 destiny 软件包基于排序后的扩散组分生成伪时间。
Naive hPSC 在 37°C、5% O 的培养箱湿润条件下进行培养
暂停状态的类囊胚通过在先前已发表的人类类囊胚扩展培养条件下培养而被重新激活（
采用口吸管收集类囊胚，并转移至U形底96孔板（Merck，BR701330）中。待结构沉降后，用PBS清洗培养基两次，并于室温下用4% PFA固定30 min，随后用PBS清洗三次，每次10 min。使用含10%正常驴血清和0.3% Triton X-100的PBS于室温下封闭并透化3 h。将一抗置于封闭/透化液中，在4 °C条件下轻柔振荡孵育，并随后使用含0.1% Triton X-100的PBS清洗至少三次，每次10 min。
二抗以含0.1% Triton X-100的PBS稀释后，于室温避光孵育1 h。随后，类囊胚用含0.1% Triton X-100的PBS清洗三次，每次10 min，并准备成像。成像时，将类囊胚置于玻底培养板中。类囊胚的共聚焦免疫荧光图像使用配备Yokogawa W1旋转盘的Olympus IX83显微镜采集（软件：CellSense 2.3；相机：Hamamatsu Orca Flash 4.0）。
共聚焦图像使用FIJI 1.53k或Bitplane IMARIS 9.7.0软件进行分析，并导出展示图像。细胞计数使用Bitplane IMARIS软件进行。通过设置体素的大小和荧光强度参数，随后利用IMARIS的spot功能获得每幅图像的总体细胞计数数据。
我们感谢Bulut-Karslioglu实验室成员、Ludovic Vallier、Michelle Percharde和Helene Kretzmer提出的重要反馈，感谢MPIMG科学平台提供的卓越服务，感谢Jennifer Shay和Cordula Mancini的协助，感谢Beata Lukaszewska-McGreal进行蛋白质组样本制备。
本项目得到以下资助：DPI获得德国学术交流中心（DAAD）博士奖学金（91730547）；VAvdW获得瑞士国家科学基金会Early Postdoc.Mobility奖学金（P2EZP3_195682）；TR获得Wellcome HDBI initiative（英国人类发育生物学倡议，360 G-Wellcome-215116_Z_18_Z）资助；NR获得欧盟“地平线2020”研究与创新计划下欧洲研究委员会（ERC）资助（ERC-Co grant agreement no.101002317，“BLASTOID：早期人类胚胎发生的发现平台”）；HHK获得奥地利科学基金（FWF）Lise Meitner项目（项目编号M3131-B）资助；EGS和ABK获得马克斯·普朗克学会资助，ABK另获Sofja Kovalevskaja奖（洪堡基金会）资助。
KKN实验室的研究工作得到Francis Crick Institute支持，该研究所的核心经费来自Cancer Research UK（FC001120）、英国医学研究委员会（UK Medical Research Council，FC001120）和Wellcome Trust（FC001120）。为实现开放获取，作者已对因本次提交产生的任何作者接受稿版本适用CC BY公共版权许可。
作者排序有误，现已更正（PDF中未更改，但网页中已更改）。
📄 原文链接：https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2023.05.29.541316
🏷️ 胚胎滞育 人类早期发育 mTOR通路 类囊胚 多能干细胞