经微图案化的人多能干细胞（human pluripotent stem cells, hPSCs）经BMP4处理后形成的体系（2D gastruloids）是目前应用最广泛的人类原肠胚形成干细胞模型之一。由于其简便性和可重复性，该体系非常适合用于组织图案化的高通量定量研究，并由此推动了我们对哺乳动物原肠胚形成机制的诸多认识。然而，2D gastruloids此前仅被研究至48小时。在本研究中，我们将该体系延长至96小时。
我们发现了一个高度可重复的形态发生阶段，在此期间，源自原条样区域的定向迁移形成了位于上胚层样层下方的中胚层层。多种类型的中胚层以显著的空间组织方式产生，包括位于集落边界的侧中胚层样细胞以及位于集落更内侧的旁轴中胚层样细胞。单细胞转录组学显示，这些细胞与人类及非人灵长类胚胎中的中胚层具有很强的相似性。然而，我们的数据提示，参考人类胚胎的注释可能需要修订。这表明，对2D gastruloids进行延长培养可为研究人类中胚层分化与形态发生提供一种强有力的模型。
中胚层是胚胎三胚层之一，在原肠胚形成过程中通过自原条迁移而形成，并且对于身体体式的建立至关重要。
2D gastruloids是最早建立的人类原肠胚形成干细胞模型之一。
我们发现，如果通过在微图案上培养24小时以确保足够高的初始细胞密度，然后再进行BMP4处理（见方法），则2D原肠胚样体在4天培养过程中仍能保持高度有序。在原肠胚样体平面（xy）内，48小时的“经典”标志物——羊膜样细胞的ISL1、原条的BRA、上胚层的SOX2——在72小时和96小时仍然存在，且组织方式大致相似：位于菌落边缘的ISL1+细胞环绕着一圈BRA+细胞，而SOX2+细胞位于中心（图1a）。
然而，在较晚时间点，还观察到相当数量的BRA+细胞散在分布于远离该环状区域的菌落中心处，在72小时最为明显（图1ab，白色箭头）。与经典标志物在xy平面中相对静态的表现不同，垂直的z方向上随时间发生了显著的形态变化。72小时时，菌落厚度相对均一，但到96小时时，边缘相对于菌落中心隆起，且菌落在径向方向上略有扩张（图1b，补充图1a）。此外，在菌落中心，到96小时时，在多层SOX2阳性细胞核下方持续存在一层对ISL1、SOX2和BRA均呈阴性的细胞。
96小时时这种边缘隆起的多层组织结构在明场图像中表现为较暗的中心以及边缘周围更暗的一圈（补充图1b）。我们开发了一套定制的图像分析流程，能够对3D中的单个细胞核进行准确分割，并获得其位置和荧光强度信息（方法，补充图1c）。单细胞定量显示，在同一实验中，菌落形态和标志物表达具有高度可重复性（图1c，补充图1d），尽管边缘与中心的相对高度以及菌落直径在不同实验之间存在一定变化。我们在三种不同的细胞系中证实了这一结果（SI图1e）。
中央上层中的细胞维持了多能性、上胚层样身份，因为SOX2阳性细胞共表达NANOG和OCT4（图1e）。对上皮标志物EPCAM和ECAD以及间充质标志物SNAI1、NCAD和VIM的染色显示，菌落顶部覆盖着连续的上皮层，其下方为间充质细胞（图1fg）。在菌落边缘、条纹样区域之外，还存在另一群间充质细胞（图1fg）。上皮顶端表面标志物PODXL仅出现在菌落表面，这表明中心区域多层多能性细胞核属于单一的假复层上胚层样结构，其下方为间充质（图1g）。
72小时时中心区域BRA+细胞的散在分布提示，该间充质可能是由细胞从原条（PS）样环迁出并随后下调PS标志物而形成的中胚层。因此，我们对PS标志物的表达进行了更为细致的研究，并发现了出乎意料的异质性。尽管BRA、EOMES和MIXL1的染色结果看起来非常相似（补充图1f,g），但它们的叠加分析和定量结果显示，在48小时和72小时时存在梯度性表达：BRA在外侧表达更高，而EOMES和MIXL1在内侧表达更高（图1h,i）。
这与它们分别在后部和前部原条中的不同作用一致，因为菌落边缘的BMP信号更高，因此类似于胚胎的后部。
为了确定所观察到的间充质群体是否确实代表不同的中胚层细胞类型，我们在48、72和96小时分别进行了重复的单细胞RNA测序。我们构建了整合的UMAP可视化图谱，并使用Leiden算法对数据进行聚类，所选择的参数使得48小时的聚类结果与此前获得并在42小时得到验证的结果一致。
差异表达分析获得了各群的标志物，其中一个簇包括TBX6、DLL3、RSPO3、FOXC1，另一个簇包括FOXF1、HAND1、TMEM88。
为了验证这些细胞的身份，我们随后将gastruloid的转录组映射到CS7期人类原肠胚上。
我们的发现提示，在CS7期人类胚胎中被注释为晚期中胚层的细胞，也可能是侧板中胚层和连接柄中胚层的混合群体。与此一致的是，该样本包含连接柄和体壁胚外中胚层（Tyser）。
免疫荧光染色证实了由TBX6和FOXF1标记的不同细胞群体的存在，并揭示了清晰的空间组织。TBX6+中胚层在中心区域类上胚层细胞下方形成一层（图3a-c，补充图3a）。此外，在48小时时，TBX6+细胞在菌落隆起部分下方形成一个环，位置对应于条带样环（图3a），这与TBX6在原条中期至晚期的表达一致。
随后，我们进一步确定了中胚层亚群的空间组织。我们发现，位于上胚层下方的中胚层层同时表达FOXC2和TBX6，而外围的TBX6+环不表达FOXC2，这提示该环可能代表晚期原条或新生中胚层，而从原条迁移到中心的细胞则是已分化的轴旁中胚层（图3j-l，补充图3j）。我们还证实，FOXF1+群体的部分亚群表达早期心脏标志物NKX2.5（图3m,n，补充图3k）以及CS标志物ALCAM（图3o,p，补充图3l）；其中，NKX2.5更多位于底部边缘，ALCAM则更靠内侧且更多位于上方，接近ISL1+羊膜。
综上，这些数据表明，中心区域及菌落边缘的间充质层代表不同的中胚层群体。
在72小时于原条样结构之外观察到原条样细胞，提示中胚层细胞群起源于该原条样区域，并从该区域迁移至菌落中心和边缘。与此一致，活细胞成像显示，BRA+细胞自约48小时开始从原条样环向外迁移，尽管迁移起始时间在不同实验之间存在一定差异（补充视频1）。此外，对BRA阳性细胞的单细胞追踪显示，在61小时位于中心的几乎所有BRA+细胞均起源于36小时的原条样环（
侧板中胚层依赖高BMP信号，而旁轴中胚层依赖Wnt信号
随后，我们在48小时后抑制Wnt信号。这并不影响FOXF1的表达，但消除了TBX6原条样环，并显著减少了中心区域的TBX6+细胞群（图4i、j，补充图5f-h）。我们纳入ISL1作为参考共染色标记，其与FOXF1部分重叠，结果发现其也不受Wnt抑制的影响。最后，我们研究了Nodal信号，因为一般认为这两类中胚层细胞群都需要降低的Nodal信号，而原条分化后较高的Nodal信号则会生成内胚层
我们将二维gastruloid的培养时间从2天延长至4天，并表明在此期间，发育以有序且可重复的方式推进，重现了此前模型尚未涉及的、更晚期原肠胚形成阶段的部分特征。我们观察到，由原条样区域发生的向内定向迁移，在中心多能性上皮下方形成了一个旁轴中胚层样层；同时还观察到向外迁移，在菌落边缘形成了一个侧板和胚外中胚层环。这些过程是自组织的，并且独立于培养基中用于启动分化的外源BMP。我们表明，通过操控细胞信号传导可以改变谱系分配。
通过改变BMP、Wnt和Nodal信号之间的平衡，细胞命运由侧向/后部转向内侧/前部。此外，我们的旁轴样和侧板样中胚层与CS7期人类胚胎中所注释的新生中胚层和进展中胚层高度相似，从而验证了这些延长培养的gastruloid可作为一个能够真实重现胚胎中胚层分化的平台。
由于该系统具有高度可重复性，并且能够随时间追踪细胞，因此它为原肠胚形成机制提供了新的见解。事实上，我们的结果表明，如今被广泛使用的“nascent（新生）”、“emergent（出现中的）”和“advanced（进展的）”中胚层这些术语
许多重要问题仍有待解答。关于驱动哺乳动物中胚层迁移的机制，目前所知甚少；例如，是否涉及化学吸引物或排斥物，或者中胚层是在何种力学机制下于类上胚层之下移动。谱系特化同样尚未得到充分理解。例如，尽管FOXF1阳性中胚层依赖于BMP信号传导，但BMP信号传导在远大于FOXF1表达区域的范围内处于高水平，因此尚不清楚BMP信号传导是在何时以及如何促使一部分条纹样细胞分化为侧板或胚外中胚层，而非轴旁中胚层。另一个有趣的问题是，系统中不同组织之间的比例由何种因素控制。
例如，尽管多能层变为假复层化，但其并未发生侧向扩张或屈曲。
据我们所知，这是唯一一个人类原肠形成模型，在该模型中，不同的中胚层谱系已被证明以时空组织化的方式产生，并通过从条纹样区域迁移而形成。二维微图案化方法非常适合研究其潜在机制，因为迁移发生于易于操控的微图案化基底上，例如可以改变其刚度或嵌入微珠以进行牵引力显微测量。
然而，技术优势与简洁性是有代价的：二维原肠胚样体缺乏许多方面的
该系统的简洁性及其由此产生的生物学局限性，不仅在于技术层面使某些问题更易于处理：在遵循研究指南和政策方面也具有显著优势。作为一种非整合型、基于干细胞的胚胎模型（SCBEM），其不含滋养层或下胚层，也不打破旋转对称性，因此这些结构的发育潜能非常有限。这在一定程度上缓解了，甚至消除了与整合型模型相关的潜在伦理顾虑，并且符合美国联邦资助政策。
本研究产生的原始单细胞RNA测序数据已存入GEO（GSE262081），分析后的数据将在发表时补充。原始图像数据可按要求提供。
所有用于数据分析和模型模拟的代码可在以下位置获得
所使用的细胞系包括胚胎干细胞系ESI017（XX）、诱导多能干细胞系PGP1（XY），以及经遗传修饰的胚胎干细胞系H9（XX）T（brachyury）-neon。
人胚胎干细胞或诱导多能干细胞在商业化界定的多能性维持培养基mTeSR1（StemCell Technologies）中培养，并接种于包被有Cultrex（R&D Systems）的组织培养板上。常规细胞维持过程中，每3天进行一次传代。对于整克隆传代，L7
为了通过微图案化诱导细胞形成二维原肠胚样体，我们遵循了 Teague 等人（2024）的方法，并在 BMP 处理前增加了微图案上的生长期以及每日换液步骤。简而言之，将细胞重悬为单细胞悬液，并接种到经层粘连蛋白包被的微图案孔中，培养基为含 ROCK 抑制剂（RI）（MeChemExpress，货号：HY-10583）的 mTeSR。初次接种 30 分钟后，用 PBS−/− 清洗微图案孔，以洗去未贴壁细胞。
随后，细胞在加入 BMP4 处理前，先于 mTeSR 中预培养 24 小时，BMP4 处理通过完全更换培养基实施。对于所有微图案化分化实验，每 24 小时进行一次含指定处理条件的完全换液。实验在微图案化 18 孔 Ibidi 载玻片（货号：81818）中进行，载玻片按前述方法制备。
18 孔 Ibidi 载玻片中的样品先以 PBS−/− 漂洗，随后在室温（RT）下用 4% 多聚甲醛固定 30 分钟，之后再用 PBS−/− 清洗两次。然后，样品在 PBS−/− 中用 0.1% Triton X-100 通透 10 分钟，并使用封闭液（PBS−/− 中含 3% 驴血清 + 0.1% Triton X-100）进行封闭。封闭后，样品于 4°C 下在封闭液中加入指定稀释度的一抗孵育过夜。
次日，样品用 PBST（PBS−/− 中含 0.1% Tween 20）清洗 3 次，随后在避光条件下于室温用含 DAPI 的二抗溶液（1 μg/ml；ThermoFisher Scientific）孵育 30 分钟。抗体及其稀释倍数列于补充表 2 和 3。染色完成后，样品再用 PBST 清洗 2 次，并加盖保存在含 0.01% 叠氮化钠的 PBS−/− 中。
固定样品成像使用 Nikon/Yokogawa 旋转盘共聚焦显微镜，配备 ×40 硅油物镜，并使用 NIS Elements AR 软件 5.41.02 版本。为提高透明度，样品在成像前按照 Zhu 等人（2019）的方法使用光学透明化缓冲液（FOCM）处理。50% FOCM 缓冲液通过在 PBS−/− 中稀释配制，并在成像前立即加入。活细胞成像使用 Andor Dragonfly/Leica DMI8 旋转盘共聚焦显微镜，配备 ×20 空气物镜，并在受控温度（37°C）、CO
我们采用先前描述的流程，基于细胞核荧光（固定细胞中的 DAPI 染色，活细胞中的 H2B::RFP）对各个 z 层切片中的细胞核进行了分割。
用于单细胞RNA测序的样本依据制造商说明书，采用10x Flex固定试剂盒进行采集。单细胞RNA测序由密歇根大学先进基因组学核心平台完成。固定后的解离细胞使用Luna Fx7（Logos Biosystems）进行计数。按照10X Genomics Chromium Fixed RNA Profiling Reagent Kits for Multiplexed Samples（PN 1000568）的制造商说明进行探针杂交、样本混合及后续处理。
最终文库质量使用LabChip GXII HT（PerkinElmer）进行评估，文库浓度使用Qubit（ThermoFisher）进行定量。混合文库按照制造商方案进行双端测序（Illumina NovaSeq X Plus）。采用BCL Convert Software（Illumina）生成去复用的FASTQ文件，并使用CellRanger 7.0.1（10X Genomics）在默认参数下，基于10x提供的人类参考基因组GRCh38进行序列比对并生成计数矩阵。
用于与CS7期人类原肠胚进行比较
进一步分析在Python环境中使用Scanpy完成
细胞核基于T-neon（brachyury）通道的最大强度投影，采用定制的CellPose模型进行分割
所有实验均至少重复两次。所有重复实验的尝试均获得一致结果。除非另有特别说明，所有定量分析均在相同实验条件下的4个菌落中进行（n=4）。
我们的研究遵守所有伦理规范。我们已获得密歇根大学人类多能干细胞研究监督委员会（HPSCRO）的批准，开展人胚胎干细胞和人诱导多能干细胞相关研究。
感谢Aryeh Warmflash和Adam Helms就稿件提出的讨论与反馈，并感谢Susana Chuva de Sousa Lopes指出Tyser等人的注释中未包含连接柄。文库制备和下一代测序由密歇根大学先进基因组学核心平台完成。本研究得到NSF RECODE（2033654）、美国国家普通医学科学研究所（NIGMS R35GM138346）以及Branco Weiss Fellowship – Society in Science的资助。
EF部分得到NIH Cellular Biotechnology Training Program（T32GM145304）的支持，KJ部分得到Michigan Pioneer Postdoctoral Fellowship和NIH F32 Ruth L. Kirschstein博士后国家研究服务奖（5F32HD108980-02）的支持。
📄 原文链接：https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2024.03.21.585753
🏷️ 二维原肠胚样体 人多能干细胞 中胚层发育 原肠胚形成 单细胞转录组